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孕妇外周血胎儿细胞
  

     一、孕妇外周血胎儿细胞的类型
  1893年已证明孕妇的肺循环中有滋养叶细胞存在,以后陆续有报道孕妇外周血中其他类型的胎儿细胞的存在。孕妇血中胎儿细胞的主要类型包括滋养叶细胞、淋巴细胞、粒细胞、单核细胞、有核红细胞(NRBC)等。直到1969年才考虑到将孕妇血中胎儿细胞作为产前遗传病诊断的材料[1]。
  滋养叶细胞虽因其形态大易于鉴别,但在早孕母血中含量极少且迅速陷于肺组织中更使其在孕妇周围血含量更微,再者其所含染色体并非总是与胎儿相符,是因其多核特点及其与胎盘的嵌合现象所致,所以滋养叶细胞不是理想的产前诊断细胞。胎儿淋巴细胞用作产前诊断有相当的潜力,因其表达HLA抗原,故当父母的HLA不同时,更易分离、鉴别与富集,但当父母HLA相同时则无特异性的鉴别与分类、富集方法;但胎儿淋巴细胞产生太迟(孕中期),失去早期诊断意义;另外胎儿淋巴细胞在孕妇血中生存期长,达数年或更长,易造成误诊(多次妊娠者),因此胎儿淋巴细胞也不是最理想的产前诊断材料。其他的白细胞如粒细胞、单核细胞等研究得不多,特异性也不高。目前认为最合适作产前诊断的胎儿细胞类型当首推胎儿有核红细胞,理由是:(1)胎儿有核红细胞是单核的,孕早期胎儿血中含量丰富但孕妇外周血中罕见;(2)其表达几种特异的抗原如运铁蛋白受体和特异的胎儿血红蛋白肽链如ζ链和γ链,作为细胞标记而利于细胞的分类、鉴定和富集;(3)其在孕妇外周血中的生存期短,不会持续到下一次妊娠。但值得注意的是早孕期孕妇外周血的有核红细胞大都是孕妇本身产生的[2,3]。
  二、胎儿细胞的富集、鉴别及分析技术
  由于孕妇血中胎儿细胞的数量太少,大约是孕母血细胞的1/105~1/109[4],必须进行分离纯化才能利于进一步分析、作产前诊断。目前,分离胎儿细胞有多种手段,主要包括密度梯度离心、流式细胞分类计、磁激活细胞分类(MACS)、荧光激活细胞分类(FACS)、选择性细胞培养技术、尼龙毛柱分离法、单独溶解红细胞法等。
  Johansen等[5]分别采用5种不同的方法对滋养叶细胞进行分离的研究表明,单独溶解红细胞法是获得滋养叶细胞的最好途径,当与Ficoll密度梯度离心法联用时则获得的纯度低且费时。FACS尽管富集力强(3250倍)且纯度高,但收获率低(8%)。外包裹有抗CD16抗体的免疫滋珠法是进行滋养叶细胞免疫细胞化学特征研究的最好方法。包裹有CD45抗体的IO珠法是分离用于产前诊断的滋养叶细胞最常用的方法,因其纯度高,富集能力强(32倍)且收获率高(78%)。Wachter等[6]用电荷流式分类(CFS)法对16例孕妇(怀男婴13例、Downs氏综合征2例、18三体死婴1例)外周血样进行初步分离,发现每20ml血样中平均有2000个胎儿NRBC,均经与染色体的荧光原位杂交(FISH)证实。Bianchi等[7]应用针对胎儿红细胞抗原即运铁蛋白受体(CD 71)、thromfospondin受体(CD 36)和血型糖蛋白A(GPA)的三种不同的单克隆抗体方法作为荧光激活细胞流式分类。结果表明用抗CD 71或CD 36鉴别出胎儿性别的精确度分别为57%和88%,而用抗GPA分离的细胞预报胎儿性别的正确率为100%。Steel等[2]开发了一种快速、价廉的简易技术从孕妇周围血中富集红细胞,其原理是在初步消除孕妇血中的单核细胞后接着进行阳性选择。其程序为收集早期或中期孕妇周围血,通过Ficollhypaque密度梯度离心分离得单核细胞(包括有胎儿有核红细胞)混悬液,然后用抗CD 45/抗CD 14的混合剂(与孕妇血中的大部分单核细胞起免疫反应)处理,接着加入粘附于含铁胶粒的山羊抗鼠IgG,并形成含铁的非有核红细胞及单核细胞,在磁场的作用下这些细胞被吸引住并将其弃除,余下有核红细胞。最后一步是有核红细胞的阳性选择。首先加入CD 71抗体,然后象上述一样加含铁溶液,再次混合并放置于磁场中,此时,粘附于磁极大多是有核红细胞,洗净后将其从磁极中移开即可进行FISH分析。Simpson等[8]在研究持续流式方法及其敏感性、特异性时发现,五种血型糖蛋白A的抗体均产生凝集作用,故不将其作为胎儿细胞的阳性选择标记,而以CD 71+细胞或γ球蛋白阳性细胞作为阳性选择是成功的,分别发现10/18例和12/14例46,XY的男性胎儿细胞。为去除孕妇血本身的有核红细胞污染及更有效地富集胎儿细胞,一般地使用MACS法,此法(通过使用 CD 45-阴性选择)导致的血细胞降低范围是7~34倍,但能富集有核红细胞达1000倍[9],而应用"双MACS"法则使孕妇血单核细胞CD 45+和CD 14+的平均清除率为780倍,CD 71+有核红细胞的平均富集率为500倍,回收率为40%~55%[10]。Van Wijk等[11]报告了他们有效富集胎儿滋养叶细胞的两步骤方法。首先从早孕孕妇外周血中分离、富集滋养叶细胞,然后用高度特异性的巢式X/Y PCR进行分析鉴定,敏感到足以探测单个细胞特异性X和Y染色体序列以及100000个雌性细胞间鉴别出一个雄性细胞,通过本技术预报性别与传统核型分析比较,成功率为91.7%。
  如上所述,用Y染色体探针对男性胎儿细胞进行鉴别和预报是可行的,但如用胎儿细胞进行遗传病产前诊断则必须鉴别出分离富集到的有核红细胞是否是胎儿来源的,识别胎儿细胞的标记必须是与性别无关的。只有这样才能作出准确的产前诊断。目前用于识别胎儿细胞的标记包括胎儿血红蛋白、HLA-G、HLA-DQ、2,3-二磷酸甘油酸(BPG)及胸腺嘧啶核苷激酶法等。Von Koskull等[12]发现含有血红蛋白的胎儿幼红细胞用BPG处理后,再用过氧化酶反应即呈可见的红色阳性反应。用本方法研究发现13/14例正常孕妇(胎龄6~19周)有胎儿幼红细胞。Geifman-Holtzman等[13]利用与父方的HLA-DQαAl等位基因互补的特异性引物对从母血中分离到的胎儿细胞作PCR扩增,结果发现6/12例样本有扩增带,提示父传的HLA-DQαAl基因型的存在,而6/12例样本无扩增带,胎儿基因型预报率100%后均经羊膜腔穿刺术等方法来验证。最近发现有可能成为识别胎儿细胞的新的标记是细胞内DNA前体途径酶即腺苷嘧啶核苷激酶活性增加[14]。用已分离和鉴别的胎儿细胞进行产前诊断的技术方法主要有PCR及FISH。PCR着重于母体所缺的父传基因突变或多态性的诊断,FISH则依赖于特异的染色体探针(如X、Y、21、18染色体探针等)对染色体疾病进行产前诊断[4]。
  三、临床应用
  目前已有一些用孕妇外周血胎儿细胞进行产前诊断的成功报道,但很多尚处于起步阶段,有些临床应用研究尚在进行当中,大群体产前诊断的敏感性和特异性也有待于以后作出评价。除性别(男性)外,已进行过产前诊断的疾病包括染色体异常和单基因疾病等。
  Camaschella等[15]研究怀有β-地中海贫血/血红蛋白Lepore胎儿可能的三名高风险孕妇,男方均携带有HbLepore突变基因。PCR的结果两名孕妇外周血样有Lepore基因的阳性讯号,另一名孕妇无阳性讯号,均经绒毛取样(CVS)分析证实。Geifman-Holtzman等[16]最近发表的研究结果表明Rh阴性的孕妇在早孕及中孕期取外周血通过FACS富集NRBC预报胎儿Rh状态的特异性为100%,敏感性为84%。Price等[17]研究一名10周孕龄的孕妇,其外周血进行流式分类,然后分别用Y、18染色体探针进行FISH,结果8.7%的细胞与Y探针有杂交信号,8.5%显示三个18染色体探针杂交信号,产前诊断为18三体男性胎儿,后经CVS和核型分析证实。Ganshirt-Ahlert等[18]的研究表明怀18三体胎儿的孕妇外周血经分离富集后至少有8%(平均12%)的细胞显示18染色体的三个杂交信号,而正常孕妇少于5%(平均2.5%);除了21三体、18三体外,其它已进行产前诊断的非正倍体胎儿尚有13三体,69,XXX,45,X/46,XX,47,XXX,47,XXY等,而以21、18及13三体作出的产前预报较为准确[2]。Sekizawa等[19]最近成功地从8~10周孕龄的孕妇外周血中分离出单个NRBC进行Duchenne型肌营养不良的产前诊断。NRBC用Percoll非连续密度梯度进行分离,并在显微镜下用微操作器收集。单个细胞的全部基因组通过引物延伸预扩增(PEP)法进行扩增。以PEP反应的小部分产物可决定性别。一旦确认NRBC是男性胎儿来源的、肌营养不良外显子4、8、12、45、50和51即以同样的PEP反应中被鉴别。
需要注意的问题
  一、首先是细胞类型的选择。虽然孕妇静脉血中的NRBC是产前诊断最有指望的细胞类型(因其生存期短,反映最近一次妊娠进入母体外周血的胎儿细胞且在非妊娠妇女中罕见),但近年已有证据表明发现于孕妇外周血中的有核红细胞大部分是来源于孕妇本身,本质上妊娠可诱导孕妇体内产生NRBC。因此需要更有效更特异的富集技术以获得足够的来源于胎儿的NRBC,才能进行可靠的产前诊断[3]。
  二、其次是在孕早期胎儿细胞是否进入孕妇外周血以及是否有前次妊娠造成的胎儿细胞污染。Thomas等[20]的研究发现,所有怀男婴的孕妇外周血用PCR方法均能扩增出特异性的Y染色体DNA,检测时间最早是4周零5天,最迟是7周零1天。分娩后8周,怀男婴的产妇外周血无一例能检测到特异的Y染色体序列。因此证实孕早期孕母血即出现胎儿DNA,一直到分娩后2个月才消失,在孕早期用孕妇外周血的胎儿细胞进行遗传病的产前诊断是可能的,且不必担心前次妊娠导致的污染。
  三、伦理学的考虑。由于用孕妇外周血胎儿细胞进行产前基因诊断为非侵入性,许多夫妇是否不适当地用于性别选择是值得注意的[1]。
评价
  正如上述,利用孕妇外周血胎儿细胞进行产前诊断的基础研究已取得很大进展,临床应用研究也取得了初步成功。在高风险孕妇,对染色体异常及单基因疾病胎儿已作了成功的产前诊断。这些技术的成熟将改变侵入性产前诊断的方式,而对低风险的孕妇群体,无论其年龄大小均能乐于接受检查,在此基础上结合侵入性的产前诊断使检测质量大大提高,并可降低或避免侵入性产前诊断带来的流产等并发症。但目前仍然存在的问题是胎儿细胞分离过程中的母血污染问题,以及影响孕妇周围血中胎儿细胞状态的因素如孕龄、血型及孕妇疾病等。随着单个细胞水平的分离技术及基因诊断技术的进步,孕妇血细胞的污染问题将最终得到解决。

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